多重qPCR的实验设计要求比单一反应体系复杂得多。用于检测不同目标的探针必须携带具有不同光谱范围的荧光基团★。下图是几种常见荧光基团的发射光谱。从图中可以看出，虽然许多荧光光谱相似的荧光基团的最大发射波长不同，但在附近的波段内，它们仍然会相互重叠。有必要避免荧光基团的发射光谱之间的相互干扰。
多重PCR？多重qPCR？这两种产品有什么区别★？分别应用在什么方面呢★？这对刚了解生命科学行业领域的技术支持/销售的朋友来说是非常陌生且晦涩的，这两个产品涉及的知识点是比较多的，它不像普通PCR产品一样，将Taq DNA聚合酶、引物★、dNTP及缓冲液“捣鼓捣鼓”一下上机扩增就行了。
多重PCR具有许多优势，但其操作复杂度较高，对实验室环境的控制要求严格，从仪器的校准、模板的准备、PCR引物的设计到反应条件的优化★，每个环节都需要精心设计和操作★。而且，mPCR检测也可能面临假阳性或假阴性结果问题，在这方面需要仔细监测和避免。同时mPCR具有高效性★、系统性和经济简便性等特点。而且，mPCR所涵盖的范围广（基因诊断、肿瘤诊断、病原微生物检测、基因分型、连锁分析★、植物分子育种★、基因表达检测、病虫害检测以及病原污染检测等），能够同时对多个靶标进行检测，大幅提升检测效率的同时，还降低了检测成本。
许多研究证实★，理想的内参基因并不存在，不同的处理因素以及不同组织中内参基因表达的稳定性是不一致的。因此★，在进行内参基因选择时，应根据不同实验条件进行仔细的分析和确证，从而选择合适的内参基因。对于目标基因表达水平要求精确时，传统的单一内参基因存在一定的局限，建议使用两个或多个基因作为内参★。
（九）肽核酸探针★：是一种人工合成的DNA类似物★，结构上保留了DNA的碱基和脱氧核糖，只是原本的核糖-磷酸骨架被类似肽键的酰胺键骨架（图中红圈标注）取代。因此★，PNA依然遵循碱基互补配对原则★，而骨架则由原本的负电性转为近中性★，减弱了双链核酸之间的静电斥力作用，使得LNA与DNA或RNA的结合稳定性和特异性均大为提高★。而且，PNA的酰胺键骨架不易被核酸酶和蛋白酶水解，使其在体内和体外均极其稳定。
是指在每个样品中加入的具有已知浓度的特殊RNA或DNA。外源性阳性对照通常是来自可以作为内部阳性对照（IPC）的体外成分，可区分真正的目标阴性和PCR抑制。此外，外源性对照还可均一化样品提取或逆转录中互补DNA（cDNA）合成的效率差异★。无论是否使用阳性对照，使用含有ROX染料的参比荧光对照都是十分重要的★，因为它可以对非PCR相关的荧光信号波动进行均一化。注：添加不会干扰靶序列扩增的人工合成的内参基因，只能用来监测扩增或提取等过程。
（十）锁核酸探针★：是一类经过修饰的高亲和力RNA类似物★，其2-O和4-C位之间通过亚甲基连接，限制了呋喃核糖环的灵活性★，将其★“锁定”为刚性的双环结构★，但不影响其遵循Watson-Crick碱基配对原则，同样可与互补的DNA或RNA杂交形成双链体。
PCR实验室中的气溶胶污染来源于两个过程：样本制备过程和PCR扩增过程★。在样本制备过程中，样本液体面与空气摩擦就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管、开盖时、吸样时及加样器的反复吸样都可能形成气溶胶而污染；PCR扩增过程可以引起实验室中扩增产物的累积，通常一次典型的PCR扩增可以产生109拷贝的靶序列，如果气溶胶化，甚至最小的气溶胶都会含有106拷贝的扩增产物★。
值得一提的是，在不同的荧光定量PCR仪中，使用的ROX染料各不相同。ROX是一种惰性参比染料，不参与荧光定量PCR反应，荧光信号值不会随反应而改变。但是由于耗材质量、机器稳定性、照明不均匀、反应体系的浓度等原因造成每个样品孔会有微小的差异，ROX可作为阳性参比★，对荧光信号进行归一化校正★。因此，在进行荧光定量PCR前★，需要了解所用的仪器型号是否需要加入ROX进行光学校正★。
探针是一种用于探测、测量或识别目标物质的工具或技术★。在科学研究和医学诊断中，探针通常是一种特定的分子或物质，能够与目标分子或结构特异性的结合或交互作用★。探针可以用于探测生物分子（如DNA★、RNA★、蛋白质）、细胞结构、病原体等★，从而实现对这些目标物质的检测、定量或定位。在分子生物学中，探针通常是一段特定序列的DNA或RNA分子★，用于与目标DNA或RNA序列特异性结合★，例如引物探针用于PCR反应中★。在生物成像和细胞生物学中，探针可以是荧光染料或标记物，用于标记和可视化特定细胞结构或分子★。在医学诊断中，探针可以是用于检测病原体或疾病标志物的分子探针，用于早期诊断和监测疾病的进展。
（八）LUX探针★：是用于qPCR的标记探针★，用于与目标序列杂交并产生荧光以指示比对。它包含称为LUX™引物的环结构引物。它具有与目标互补的序列和荧光报告基因。这里报告分子发出的荧光被发夹的二级结构淬灭，因此不需要淬灭分子★。
多重PCR（multiplex Polymerase Chain Reaction★，mPCR），又称为多重引物PCR或复合PCR，其基本原理与常规PCR相同，区别在于多重PCR反应体系加入两对或两对以上的引物，各对引物分别结合在模板相对应部位★，最终它能够在同一PCR反应管中检出多种基因，或对多个基因型目的基因进行分型★，特别适用于微量样本的多基因检测★。
熟悉多重qPCR产品的朋友应该知道，多重qPCR实验并不是简单地将多对特异性引物混合成一个反应体系就好了。多重qPCR之所以复杂困难，在于存在多个靶点之间扩增条件不兼容，每个靶点都需要引物的配合，就好比：★“两人绑腿赛跑★”，每个靶点的成功扩增都需要被捆绑在一起的两个人（一对引物）默契配合。而多重PCR就需要多对选手同时起跑又同时到达，并且所有参赛的每对选手都有最好的★，且均衡的发挥★。
多重PCR？多重qPCR？这两种产品有什么区别？分别应用在什么方面呢？本文对这几个问题进行了细致阐述。
通过查阅大量资料发现，多重qPCR探针有多种类型★，如TaqMan水解探针★、分子信标探针、双重杂交探针★、小凹槽结合剂（MGB）探针、Amplifluor检测探针、蝎子探针、LUX探针和QZyme探针等★。这些探针各有优势，应用场景也各不相同★。而在市面上常见的多重qPCR检测试剂盒中，常用的多重qPCR探针为★：TaqMan水解探针和分子信标探针。下面主要针对这8种探针进行简单介绍：